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目前自然界中，发现的CRISPR-Cas系统共分为三类：I， II 和III类，我们现在用的最常见的Cas9属于II类，今天我们就系统的和大家聊一下：

实际上，在每个大类内部，根据不同的分类原则，共计分为10个小类（图1）。三大类中的不同种类Cas蛋白的功能，决定了每一类拥有不同降解外源基因组的机制。

图1. 不同物种中，根据Cas蛋白的不同，将整个CRISPR系统分为3大类，10小类。I类的标记基因是Cas3（紫色）；II类的标记基因是Cas9（褐色）；III类的标记基因是Cas10（蓝色）。

共同点：

Cas1基因编码一种金属依赖的DNA酶，这种酶无序列特异性，其功能是参与外源基因的spacer整合到CRISPR盒子中（CRISPR cassettes）；

Cas2基因编码一种金属依赖的核糖核酸内切酶，其功能是参与Spacer的获得；

这些共同点决定了，拥有CRISPR系统的物种，获取外源spacer的机制是一致的（图2）。

不同点：

区分三类的标签基因（signature gene）：

I 类： Cas3基因，属于解旋酶家族成员；

II 类：Cas9基因，含有核酸酶的2个结构域： RuvC 和 HNH；

III 类：Cas10基因，其具有和核酸聚合酶以及核酸环化酶同源的结构域；

下面详细讲解下这三类CRISPR系统：

I 型CRISPR

I 型CRISPR的标签基因是Cas3（紫色）。在不同的物种中，又将I 型细分为6个亚型（I-A-E），图3。

图3. I 型CRISPR的六个亚型

I 型CRISPR包含8个Cas基因：Cas3,Cse1, Cse2, Cas7, Cas5, Cas6e, Cas1, and Cas2。其中，除了Cas3，其余的Cas基因都位于同一个启动子后面，这即是我们在大学时考分子生物时经常考到的一个名词解释：多顺反子。【想到名词解释，当年是多么痛苦？关键还要英文描述……】

图4. I 型CRISPR的机制

在表达阶段（图4. a），I 型会产生三个部分：Cas3，Cascade（Cse1, Cse2,Cas7, Cas5和Cas6e的复合物）和pre-crRNA。Pre-crRNA通过Cascade中的Cas6e来剪切加工获得成熟的crRNA，并和Cascade继续形成复合物状态。

在降解阶段（图4. b），成熟crRNA和Cascade形成的复合物在外源基因上找到和crRNA匹配的位点后，则形成了R型的环状结构，Cascade构象改变，招募Cas3，由Cas3内切酶行使剪切外源基因的功能。

我们常用的E.coli就属于I 型，不过要注意的是，并不是每种细菌都只有一种类型的CRISPR，有部分细菌同时拥有三种类型，有的拥有两种，想必这个也是进化的结果。不过，病毒等外源“侵略者”也不是好欺负的，通过M13噬菌体侵染E.coli实验，发现有的噬菌体并没有被干掉，原因是其基因组中和crRNA想对应的基因发生了点突变，这就是所谓的“免疫逃逸”，正所谓，道高一尺魔高一丈！

II 型CRISPR

如前所述，II 型CRISPR系统有2个亚型：II-A和II-B（图5）。两者的区别在于II-A包含有csn2基因，而II-B包含的是csn4基因。关于csn2和csn4基因的功能，目前认为其参与了外源基因组spacer的获取等功能。

图5. II 型CRISPR系统的两种亚型

目前，研究比较深入的是II-A，它也有2种：一种是长的Cas9基因和短的csn2基因，另外一种是短的Cas9基因和长的csn2基因，另外，两tracrRNA的位置也不一样（图6）。

【现在常用的Cas9是长片段的，为什么没有人做短片段的？张峰后来做的saCas9是否是短的？等有时间再明确下，有知道的麻烦回复我】

图6. 两种 II-A型CRISPR基因结构图

（红色的*代表tracrRNA。tracrRNA所处的位置不一样）

II型CRISPR在清除外源基因过程中，不同于I型CRISPR，有其特殊的机制。首先需要tracrRNA，其次需要体内RNaseIII的参与（图 7）。

图7. II型CRISPR剪切机制

如果在用CRIPSR进行基因组编辑的朋友，对这个流程应该比较熟悉，因为，我们现在常用的KO系统，就来源于II型CRISPR。大概的步骤如下（图 7）：

1. tracrRNAs和pre-crRNA中的重复片段区域杂交，Cas9和crRNA-tracrRNA结合；

2. RNase III从spacer的5’端开始剪切，产生不同类型的成熟的crRNA-tracrRNA-Cas9的复合物；

3. 第2步产生的复合物和相匹配的外源基因结合并剪切，这个过程需要PAM位点。

回顾 II 型CRISPR机制的发现过程，深深感觉，基础研究积累到一定程度，在应用上一定爆发。2007年开始，II 型CRISPR的机制被不断完善的过程中，当时，已经有一些应用方向，不过主要用在菌株鉴定和分型。同时，因为II 型CRISPR是在S. thermophilus中发现的，S. thermophilus是用来发酵酸奶和奶酪等益生菌产品的菌种，噬菌体污染是一个大问题，所以，研究人员就开始利用新发现的机制来指导开发更牛逼的对抗不同噬菌体的菌体，降低损失，提高产量。不过，研究菌的人，怎么也不会想到用它来开发基因组编辑工具，尽管现在看来似乎是很容易的一件事情。反而被搞晶体的Jennifer A. Doudna，搞遗传的 George M Church和搞神经生物学的Zhang Feng所采用并开发。因此，不同方向的交叉学习是多么重要？以后不光生命科学的报告，化学的，环境的，医学的，电子工程的，材料的都应该去听听……

III 型CRISPR

古细菌中，75%的类型是III 型CRISPR；而在细菌中，约40%。III 型CRISPR的标签基因是Cas10。III 型CRISPR又分为两种亚型：III-A和III-B，其中III-A的标签基因是csm2，III-B的标签基因是cmr5（图8）。

图8. III 型CRISPR的两种亚型，（a）为III-A，（b）为III-B。黄色为标签基因。

目前，很多种临床中分离的致病菌属于III 型CRISPR，比如S. epidermidis（葡萄球菌），其中的spacer可以抵抗外源的抗性质粒以及病毒侵染。

不同于I和II型CRISPR系统，III 型CRISPR系统中，对于crRNA的加工经过2个步骤：初始加工和成熟处理（图9）。

图9. PrecrRNA经过初始加工后，分别形成独立中间状态的crRNA，之后经过3‘端核酸酶的剪切，形成成熟的crRNA。

对中间状态crRNA的加工，III-A和III-B的机制不太一样。其中III-A亚型的加工，需要有剪切位点和发夹结构，加工需要的酶为：Cas6,Csm4, 和/或 Csm1等（图10）；III-B的加工主要是由Cas6来执行，Cas6形成二聚体和crRNA上游的重复序列结合（非发夹结构，图11）。

图10. III-A型CRISPR中crRNA成熟加工机制

图11. III-B型CRISPR中crRNA成熟加工机制

讲完crRNA的加工，下面聊一聊III型CRISPR如何对外源基因进行剪切的。在得到成熟的crRNA后，会形成Cmr-Cas/crRNA复合物，结合到相对应的外源基因后，行使剪切功能。剪切位点位于crRNA序列3’上游14个碱基处（图12）。

图12. III型CRISPR的剪切机制

三种CRISPR的系统就是这些，可能我懂得都是比较表面的东西，只希望对于刚了解CRIPSR的人有个整体印象。实际上，关于每个系统背后，都有很多细节的内容，还有很多未知的疑问等待发掘，完全做CRIPSR机制研究的可以挖的更深些。